放射性同位素的主要作用

同位素示蹤法（isotopic tracer method）是利用放射性核素作為示蹤劑對研究對象進行標記的微量分析方法，示蹤實驗的創(chuàng)建者 是Hevesy。Hevesy于1923年首先用天然放射性212Pb研究鉛鹽在豆科植物內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)移。繼后Jolit和Curie于1934年發(fā)現(xiàn)了人工放射性，以及其后生產(chǎn)方法的建立（加速器、反應(yīng)堆等），為放射性同位素示蹤法的更快的發(fā)展和廣泛應(yīng)用提供了基本的條件和有力的保障。

同位素示蹤法基本原理和特點

同位素示蹤所利用的放射性核素（或穩(wěn)定性核素）及它們的化合物，與自然界存在的相應(yīng)普通元素及其化合物之間的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)是相同的， 只是具有不同的核物理性質(zhì)。 但是，穩(wěn)定性同位素作為示蹤劑其靈敏度較低，可獲得的種類少，價格較昂貴，其應(yīng)用范圍受到限制；而用放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度，測量方法簡便易 行，能準確地定量，準確地定位及符合所研究對象的生理條件等特點：

1.靈敏度高

放射性示蹤法可測到10-14－10-18克水平，即可以從1015個非放射性原子中檢出一個放射性原子。它比目前較敏感的重量分析天平要敏感108-107倍，而迄今最準確的化學(xué)分析法很難測定到10-12克水平；

2.方法簡便

放射性測定不受其它非放射性物質(zhì)的干擾，可以省略許多復(fù)雜的物質(zhì)分離步驟，體內(nèi)示蹤時，可以利用某些放射性同位素釋放出穿透力強的r射線，在 體外測量而獲得結(jié)果，這就大大簡化了實驗過程，做到非破壞性分析，隨著液體閃爍計數(shù)的發(fā)展，14C和3H等發(fā)射軟β射線的放射性同位素在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)實驗 中得到越來越廣泛的應(yīng)用；

3.定位定量準確

放射性同位素示蹤法能準確定量地測定代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)變,與某些形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合（如病理組織切片技術(shù)，電子顯微鏡技術(shù)等），可以確定放射性示蹤劑在組織器官中的定量分布，并且對組織器官的定位準確度可達細胞水平、亞細胞水平乃至分子水平；

4.符合生理條件

在放射性同位素實驗中，所引用的放射性標記化合物的化學(xué)量是極微量的，它對體內(nèi)原有的相應(yīng)物質(zhì)的重量改變是微不足道的，體內(nèi)生理過程仍保持正 常的平衡狀態(tài)，獲得的分析結(jié)果符合生理條件，更能反映客觀存在的事物本質(zhì)。 放射性同位素示蹤法的優(yōu)點如上所述，但也存在一些缺陷，2H是1H的兩倍，當用氚水（3H2O）作示蹤劑時，它在普通H2O中的含量不能過大，否則會使水的物理常數(shù)、對細胞膜的滲透及細胞質(zhì)粘性等都會發(fā)生改變。但在一般的示蹤實驗中，由同位素效應(yīng)引起的誤差，常在實驗誤差內(nèi)，可忽略不計。放射性同位素釋放的射線利于追蹤測量，但射線對生物體的作用達到一定劑量時，會改變機體的生理狀態(tài)， 這就是放射性同位素的輻射效應(yīng)，因此放射性同位素的用量應(yīng)小于安全劑量，嚴格控制在生物機體所能允許的范圍之內(nèi)，以免實驗對象受輻射損傷，而得錯誤的結(jié)果。

示蹤實驗的設(shè)計原則

設(shè)計一個放射性同位素的示蹤實驗應(yīng)從實驗的目的性，實驗所具備的條件和對放射性的防護水平三方面著手考慮。δ =n’/n表示放射性標記的分子數(shù)n’與總分子數(shù)（標記的加未標記的）n之比。采用放射性同位素示蹤技術(shù)來實現(xiàn)所研究課題預(yù)期目的全部或一部分，一般須經(jīng) 過實驗準備階段，實驗階段和放射性廢物處理三個步驟。

（一）實驗準備階段

1.示蹤劑的選擇

選定放射性示蹤劑的比活度λqδ的值必須足夠大，以保證實驗所需要的靈敏度，而又要盡可能地小，使得在該實驗條件下輻射自分解可忽略。一般情 形是根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒炛芷陂L短，來選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。在任何一種生產(chǎn)方法中，生產(chǎn)步驟很可 能包含或多或少的化學(xué)處理，因而示蹤實驗人員需要了解某個核素及其周圍的那些元素的化學(xué)性質(zhì)，因為它們有可能成為此放射性同位素的雜質(zhì)。

放射性同位素都衰變（經(jīng)過或不經(jīng)過中間狀態(tài)）到處于基態(tài)的子體核素，衰變時伴隨各種形式的能量輻射，如α、β-、β+、γ、X放射等。在選 擇示蹤劑時，示蹤實驗人員要仔細研究衰變綱圖，并使得放射性廢物容易處理，在實際工作中，使用的放射性同位素的半衰期應(yīng)該與實 驗需要持續(xù)的時間t相適應(yīng)，如對于某個實驗，t/τ=0.04時，應(yīng)所選放射性同位素的衰變校正為3.5%；而t/τ=0.10時，應(yīng)選放射性同位素的衰變校正為6.6%。t/τ=0.15時，應(yīng)選用其衰變校正為10%。

在體外示蹤條件，一般選用半衰期較長而射線強度適中，既利于探測，又易于防護和保存的放射性示蹤劑。體內(nèi)示蹤條件下，若實驗周期短，應(yīng)選用半衰期短，且能放出一定強度r射線物放射性同位素，若實驗周期長，如需要將動物活殺后對組織臟器分別測定的，則應(yīng)選用半衰期較長放射性同位素。此外，根據(jù) 實驗?zāi)康膩磉x用定位的或不定位的標記示蹤劑，例如研究氨基酸的脫羧反應(yīng)，14C應(yīng)標記在羧基上，只有這種定位標記的氨基酸，才能在脫羧后產(chǎn)生14CO2。 而有些實驗不要求特定位置標記，只須均勻標記即可。

選擇放射性示蹤劑還必須同時滿足高化學(xué)純度，高放射性核純度的要求。在示蹤劑制備期間、貯存期間以用試驗體系中所使用的溶劑、化學(xué)試劑、酶 等可能會產(chǎn)生化學(xué)雜質(zhì)、放射化學(xué)雜質(zhì)及輻射自分解引起的放射性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在，使得示蹤實驗中使用的示蹤劑不“純”，而或多或少影響實驗的結(jié)果，甚 至?xí)��?dǎo)致錯誤結(jié)論。 氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧啶核苷（3H－UR）是兩種常用的示蹤劑，前者有效地結(jié)合到DNA中，后者則摻入到 RNA中，它們的輻射分解速度隨比較放射性的增高及保存時間的延長而增加，在不同溫度和不同溶液中的穩(wěn)定性也不同。經(jīng)保存八年的3H-TdR約有35%輻 射分解為3H－胸腺嘧啶，并導(dǎo)致二醇和水合物的形式，在實驗中這雜質(zhì)會很快摻入細胞并與大分子（很可能是蛋白質(zhì)）結(jié)合，而不是與DNA和RNA相結(jié)合，這 些雜質(zhì)用DNA酶和RNA酶處理細胞都不除去。3H－TdR和3H－UR貯存在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比+2℃增加3－4倍，但低溫度（- 140℃）對貯存也有利，在允許對示蹤實驗人員在選擇保存放射性示蹤劑時會有所啟發(fā)；

2.放射性同位素測量方法的選擇

測量方法的選擇取決于射線種類，對于α射線通常可用硫化鋅晶體、電離室、核乳膠等方法探測；對能量高的β射線可用云母窗計數(shù)管、塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對于能量低的β射線可用液體閃爍計數(shù)器測量：對于γ射線則用G-M計數(shù)管，碘化鈉（鉈）閃爍晶體探測。目前大多數(shù)實驗室主要采用晶體閃爍計數(shù)法和液體閃爍計數(shù)法兩種測量方式。

同一臺探測儀器對不同量的示蹤劑具有不同的最佳工作條件，在實驗準備階段要檢查探測器是否已調(diào)有所用示蹤同位素的工作條件，否則需要用一定量的示蹤劑作為放射源（或選用該同位素的標準源），把探測器的最佳工作條件調(diào)整好，并且要保證探測器性能處于穩(wěn)定可靠的狀態(tài)。

探測最佳工作條件的選擇方法：一種是測“坪曲線”，另一種是找最好的品質(zhì)因素。對于光電倍增管，在理論上不存在“坪”（plateau）。但隨著高壓的增 加，在一定范圍內(nèi)，脈沖數(shù)變化較小，形成一段坡度較小的電壓脈沖曲線，通常也稱其為坪。測坪曲線的方法：固定放射源，根據(jù)其射線能量的大小，初選 一個廣 大器增益（放大倍數(shù)）和甄別器閾值。不斷地改變高壓（由低到高，均勻增加伏度），每改變一次高壓，都測定一次本底和放射源的計數(shù)率，最后作出高壓本底計數(shù) 率和高壓放射源計數(shù)曲線。用同樣的方法，作另一個甄別閾值（放大倍數(shù)不變）下的高壓計數(shù)率曲線，這樣反復(fù)多作幾條曲線。相品質(zhì)因素f=ns/nb 式中ns指某種放射性樣品的計數(shù)率。找最好品質(zhì)因素的方法與 測坪曲線一樣，作出幾條高壓－F（或f）的關(guān)系曲線，在幾條曲線中選擇峰值最高的曲線。這根曲線的峰值所對應(yīng)的條件：高壓，甄別閾，放大倍數(shù)等，就是該儀 器對被測同位素的最佳工作條件。最佳品質(zhì)因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的卻在“坪”的下端。著眼于把同位素的整個能譜峰都計下來的示 蹤實驗者主張取“坪”所對應(yīng)的工作條件，而著眼于優(yōu)值者，主張取最佳品質(zhì)因素所對應(yīng)的工作條件，也有人折衷。如果某儀器本底很低，光電倍增管噪音很低和能 譜分辯高，二者應(yīng)該相差不大。同一臺儀器的最佳工作條件，隨儀器的使用期延長而有所改變，不同的放射性同位素，其最佳工作條件不同。因此核探測儀器的最佳 工作條件具有專屬性，并且要經(jīng)常通過選擇其不同時期的最佳工作條件。更不能不問被測同位素的種類，而千篇一律地使用同一個工作條件。

為了達到準確地計數(shù)，可以長時間一次計數(shù)，或短時間多次測量，兩者達到的標準誤基本相同，為避免外界因素的影響，在實際工作中，取短時間多 次測量較為合理適用。在測量樣品的放射性時，本底是一個重要影響因素。本底高，則標準誤和標準誤差都增大，尤其在樣品計數(shù)較低時，本底對標準誤和標準誤差 的影響就愈大，從而影響實驗結(jié)果的精度，而且為了達到一定的精度，勢別要增加樣品的測量時間。根據(jù)核衰變的統(tǒng)計規(guī)律，在實驗中如果樣品數(shù)量少，選擇tN= 1.4tb的比例（式中tN為樣品放射性測量時間，tb為本底測量時間）較為合理；如果樣品數(shù)量較多是一大批樣品，則延長本底測量時間tb，取tb的時間 均值，而tN則可相對短，這樣可節(jié)省時間，有利于縮短實驗周期。對于示蹤實驗設(shè)計來說，樣品中所含放射性強度的要求，是使其放射性計數(shù)率大于或等于本底計 數(shù)的10－20倍；

3.進行非放射性的模擬實驗，把實驗全過程預(yù)演一遍

同位素示蹤實驗要求準確、仔細，稍有疏忽或考慮不周就匆忙進行正式實驗，既容易導(dǎo)致實驗失敗，又會造成示蹤劑和其它實驗用品的浪費，還會增加 放射性廢物，增加實驗室本底水平，使實驗者接受不必要的輻射劑量，所以模擬實驗不僅可以檢查正式實驗中所用器材，藥品是否合格，又可以操作人員進行訓(xùn)練， 以保證正式實驗?zāi)茼樌�進行。

（二）正式實驗階段

1.選擇放射性同位素的劑量

同位素必須能經(jīng)得起稀釋，使其最后樣品的放射性不能低于本底，一般來說放射性同位素在生物體內(nèi)不是完全均勻地被稀釋，可能在某些器官、組織、 細胞、某些分子中有選擇性地蓄積，蓄積的部分放射性就會很強，在這種情況下，應(yīng)以相關(guān)部位對示蹤劑的蓄積率來考慮示蹤劑用量。在細胞培養(yǎng)，切片保溫，酶反 應(yīng)等示蹤實驗中，應(yīng)依據(jù)實驗?zāi)康摹?/SPAN>反應(yīng)時間及反應(yīng)體積的不同來考慮示蹤劑的用量，通常小于一個微居里或幾個微居里。 由于放射性同位素存在輻射效應(yīng)，應(yīng)該 根據(jù)使用的放射性核素的種類，將用量控制在最大允許劑量之內(nèi)（maximun permissible dose），以免因劑量過大所造成的輻射效應(yīng)，給 實驗帶來較大的誤差；

2.選擇示蹤劑給入途徑

整體示蹤實驗時，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康�，選擇易吸收、易操作的給入途徑，一般給予的數(shù)量體積小，要求給予的劑量準確，防止可能的損失和不必要的污染。體外示蹤實驗時，應(yīng)根據(jù)實驗設(shè)計的實驗步驟的某個環(huán)節(jié)加入一定劑量的示蹤到反應(yīng)系統(tǒng)中去，力求操作準確，仔細；

3.放射性生物樣品的制備

根據(jù)實驗?zāi)康暮?/SPAN>示蹤劑的標記放射性同位素的性質(zhì)制備放射性生物樣品，其中放射性同位素的性質(zhì)是生物樣品制備形式的主要依據(jù)。不論采用何種測量方法，都應(yīng)該對樣品作定量采集。對某些放射性分散的樣品，應(yīng)當作適當濃集，如測 定組織內(nèi)蛋白質(zhì)的放射性，應(yīng)對蛋白質(zhì)作提取處理然后制備成相應(yīng)的測量樣品。有些樣品需采用灰化法，但灰化法對易揮發(fā)的同位素或易揮發(fā)的組織樣品不合適；

4.放射性樣品的測量

測量方法分為絕對測量和相對測量。絕對測量是對樣品的實有放射性強度作測量，求出樣品中標記同位素的實際衰變率，在作絕對測量時，要糾正一些 因素對測量結(jié)果的影響，這些因素包括儀器探頭對于放射源的相對立體角、射線被探頭接收后被計數(shù)的幾率、反散射、 放射源的自吸收影響等等。但是當樣品與探頭之間相距較遠時，由于樣品 與探頭之間形成的相對立體角較小，所以兩者計數(shù)率的差異會顯著減小。在用紙片法測量3H標記物的放射性強度時，要注意紙片在閃爍瓶中的位置，一批樣品應(yīng)該 一致，如果是將濾紙剪成圓狀作支持物，圓片的直徑最好與閃爍瓶底的直徑相等，保證濾紙在閃爍瓶內(nèi)的位置固定。減小幾何條件對放射性測量的影響可以從三方面 入手：⑴選擇探測窗大的探測器，如光電倍增管作探頭的探測器；⑵在樣品制備時，注意盡量將樣品做成點狀源，這樣當樣品的放射性強度較弱時，由于距離探測窗 較近而有可能造成的水平位移的影響就可以忽略；⑶無論樣品距離探測窗遠近，樣品都應(yīng)置于探測窗的垂直軸線上，以減少樣品與探測窗之間的相對立體角。

（三）放射性去污染和放射性廢物處理

放射性實驗，無論是每次實驗或階段性實驗結(jié)束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性廢物的出現(xiàn)，因此，在實驗結(jié)束后，要作去污染處理和放射性廢物處理。必要時在實驗過程進行中，就要作除污染和清理放射性廢物的工作。

在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用

放射性同位素示蹤法在生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛，它為揭示體內(nèi)和細胞內(nèi)理化過程的秘密，闡明生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)起了極其重要的作 用。近幾年來，同位素示蹤技術(shù)在原基礎(chǔ)上又有許多新發(fā)展，如雙標記和多標記技術(shù)，穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)，活化分析，電子顯微鏡技術(shù)，同位素技術(shù)與其它新技 術(shù)相結(jié)合等。由于這些技術(shù)的發(fā)展，使生物化學(xué)從靜態(tài)進入動態(tài)，從細胞水平進入分子水平，闡明了一系列重大問題，如遺傳密碼、細胞膜受體、RNA-DNA逆 轉(zhuǎn)錄等，使人類對生命基本現(xiàn)象的認識開辟了一條新的途徑。下面僅就同位素示蹤技術(shù)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用的幾個主要方面作一介紹。

1.物質(zhì)代放謝的研究

體內(nèi)存在著很多種物質(zhì)，究竟它們之間是如何轉(zhuǎn)變的，如果在研究中應(yīng)用適當?shù)?/SPAN>同位素標記物作示蹤劑分析這些物質(zhì)中同位素含量的變化，就可以知道 它們之間相互轉(zhuǎn)變的關(guān)系，還能分辯出誰是前身物，誰是產(chǎn)物 ，分析同位素示蹤劑存在于物質(zhì)分子的哪些原子上，可以進一步推斷各種物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)變機制。為了 研究膽固醇的生物合成及其代謝，采用標記前身物的方法，揭示了膽固醇的生成途徑和步驟，實驗證明，凡是能在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?/SPAN>乙酰輔酶A的化合物，都可以作為生成 膽固醇的原料，從乙酸到膽固醇的全部生物合成過程，至少包括36步化學(xué)反應(yīng)，在鯊烯與膽固醇之間，就有二十個中間物，膽固醇的生物合成途徑可簡化為:乙酸 →甲基二羥戊酸→膽固醇 又如在研究肝臟膽固醇的來源時，用放射性同位素標記物3H－膽固醇作靜脈注射的示蹤實驗說明，放射性大部分進入肝臟，再出現(xiàn)在糞 中，且甲狀腺素能加速這個過程，從而可說明肝臟是處理血漿膽固醇的主要器官，甲狀腺能降低血中膽固醇含量的機理，在于它對血漿膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)移過程的加速作用；

2.物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究

物質(zhì)在機體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律是生命活動中重要的本質(zhì)內(nèi)容，在過去的物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究中，一般都采用用離體酶學(xué)方法，但是離體酶學(xué)方法的研究結(jié)果， 不一定能代表整體情況，同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用，使有關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗的周期大大縮短，而且在離體、整體、無細胞體系的情況下都可應(yīng)用，操作簡化，測定靈敏 度提高，不僅能定性，還可作定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的兩部分的放射性比值基本相等，從而證明了產(chǎn)物 dGMP的戊糖就原標記物GMP的戊糖，而沒有別的來源，否則產(chǎn)物dGMP的堿基和核糖的比值一定與原標記物GMP的兩部分比值有顯著差別。這個實驗說明 戊糖脫氧是在堿基與戊糖不分記的情況下進行的，從而證明了脫氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接轉(zhuǎn)化而來的，并不是核糖核苷酸先分解成核糖與堿基，堿基再重新接上脫氧杭核糖。無細胞的示蹤實驗可以分析物質(zhì)在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化條件，例如以3H-dTTP為前身物作DNA摻入的示蹤實驗，按一定的實驗設(shè)計摻入后，測定 產(chǎn)物DNA的放射性，作為新合成的DNA的檢出指標；

3.動態(tài)平衡的研究

闡明生物體內(nèi)物質(zhì)處于不斷更新的動態(tài)平衡之中，是放射性同位素示蹤法對生命科學(xué)的重大貢獻之一，向體內(nèi)引入適當?shù)?/SPAN>同位素標記物，在不同時間測 定物質(zhì)中同位素含量的變化，就能了解該物質(zhì)在體內(nèi)的變動情況，定量計算出體內(nèi)物質(zhì)的代謝率，計算出物質(zhì)的更新速度和更新時間等等。機體內(nèi)的各種物質(zhì)都在有 大小不同的代謝庫，代謝庫的大小可用同位素稀釋法求也；

4.生物樣品中微量物質(zhì)的分析

在放射性同位素示蹤技術(shù)被應(yīng)用之前，由于制備樣品時的丟失而造成回收率低以及測量靈敏度不高等問題，使得對機體正常功能起很重要作用的微量物 質(zhì)不易被測定。近年來迅速發(fā)展、應(yīng)用愈來愈廣泛的放射免疫分析（radioimmunoassay）技術(shù)是一種超微量的分析方法，它可測定的物質(zhì)300多 種，其中激素類居多，包括類固醇激素，多肽類激素，非肽類激素，蛋白質(zhì)物質(zhì)，環(huán)核苷酸，酶，腫瘤相關(guān)的抗原，抗體以及病原體，微量藥物等其它物質(zhì)；